{"doi":"10.21769/bioprotoc.4043","title":"Simplified Epigenome Profiling Using Antibody-tethered Tagmentation","abstract":"We previously introduced Cleavage Under Targets & Tagmentation (CUT&Tag), an epigenomic profiling method in which antibody tethering of the Tn5 transposase to a chromatin epitope of interest maps specific chromatin features in small samples and single cells. With CUT&Tag, intact cells or nuclei are permeabilized, followed by successive addition of a primary antibody, a secondary antibody, and a chimeric Protein A-Transposase fusion protein that binds to the antibody. Addition of Mg++ activates the transposase and inserts sequencing adapters into adjacent DNA in situ. We have since adapted CUT&Tag to also map chromatin accessibility by simply modifying the transposase activation conditions when using histone H3K4me2, H3K4me3, or Serine-5-phosphorylated RNA Polymerase II antibodies. Using these antibodies, we redirect the tagmentation of accessible DNA sites to produce chromatin accessibility maps with exceptionally high signal-to-noise and resolution. All steps from nuclei to amplified sequencing-ready libraries are performed in single PCR tubes using non-toxic reagents and inexpensive equipment, making our simplified strategy for simultaneous chromatin profiling and accessibility mapping suitable for the lab, home workbench, or classroom., [摘要]我们先前介绍了在目标与标签下切割（CUT＆Tag ），这是一种表观基因组学分析方法，其中Tn5转座酶与目标染色质抗原决定簇的抗体结合作用可映射小样品和单细胞中的特定染色质特征。使用CUT＆Tag可使完整的细胞或细胞核通透，然后依次添加一抗，二抗和与该抗体结合的嵌合蛋白A-转座酶融合蛋白。Mg ++的加入激活了转座酶，并将测序衔接子原位插入相邻的DNA中。此后，我们对CUT＆Tag进行了改编也通过简单地使用组蛋白H3K4me2，H3K4me3的当修改所述转活化条件映射染色质访问性，或丝氨酸-5磷酸化的RNA聚合酶II的抗体。使用这些抗体，我们将可访问的DNA位点的标签重定向，以产生具有极高信噪比和分辨率的染色质可访问性图。所有的原子核扩增测序就绪库步骤在单个PCR管进行使用无毒试剂和廉价的设备，使我们简化战略，同时染色体分析和适合实验室无障碍映射，家庭工作台，或教室。[背景] DNA中的辅助染色质景观的映射是首先描述45年前与观察DNA酶I超敏反应在转录活性的基因座（温特劳布和Groudine，1976） 。由于DNaseI优先切割缺少核小体的基因组区域，并且调控元件与非组蛋白染色质蛋白而不是核小体结合，因此DNaseI超敏位点定位已被用于表征遗传调控态势。染色质可接近性其他酶探针包括微球菌核酸酶（MNase ）（Reeves的等人，1978） ，限制性内切酶（Jack和Eggert的，1990） ，转座（Bownes，1990） ，和DNA甲基转移酶（Gottschling等人，1992） 。随着全基因组读出平台的引入，超敏性位点定位变得更加常规化，首先是从微阵列开始，然后是短读DNA测序（Crawford等，2004； Dorschner等，2004）。染色质的可及性还利用交联染色质的物理破碎和差异回收作图，FAIRE （Giresi等，2007）和Sono-Seq （Auerbach等，2009）的基础。近年来，最流行的染色质可及性作图方法是ATAC-seq （Buenrostro等人，2013），其中转座子5（Tn5）剪切和粘贴转座反应在最易接近的基因组区域插入测序适配器（标签化）。由于标签化在插入可访问位点的同时创建了测序文库，因此ATAC-seq既简单又快速，并且相继改进的ATAC-seq协议增强了其受欢迎度（Corces等人，2016和2017）。尽管染色质可访问性映射实用，但对染色质可访问性本身的机制基础仍不完全了解。与将染色质简单地命名为“开放”或“封闭”相反，最近的研究表明，DNA中可及和不可及位点之间的中值差异估计仅为〜20％，而没有位点完全访问或在细胞群不可访问（Chereji等人，2019; Oberbeckmann 。等人，2019） 。为了更好地理解染色质辅助功能的这种细致入微的诠释，我们最近应用了我们ç leavage ü的nDer牛逼具体目标和标签的心理状态（CUT及标签）的方法进行抗体系留在原位tagmentation染色，探讨染色质的无障碍机制基础的（参见Henikoff等。（2020年）。CUT＆Tag在与染色质结合抗体结合的Protein A和与相邻DNA结合的Tn5之间使用了融合蛋白，当用Mg ++激活时就会发生标签化（Kaya-Okur等人，2019）。为了抑制未靶向可及染色质的人为标记，我们在300 mM NaCl存在下执行了从pA-Tn5融合蛋白结合到标记的所有步骤，这减少了转座酶的非特异性DNA结合。在优化的简化单管协议，的过程中CUT＆标签直接（卡亚-奥库等人，2020） ，我们偶然观察到，简单地减少抗体靶向过程中的离子浓度tagmentation大大增加拴系的Tn5到的倾向tagment访问染色质接近特定的组蛋白修饰（Henikoff et al。，2020）。优惠tagmentation可接近的染色质的仅使用针对H3K4me2与H3K4me3的抗体时出现，并没有对其他组蛋白修饰或变体。由于H3K4me2在全基因组两侧都位于启动子和增强子的两侧，因此，与抗体相连的Tn5对附近可访问的DNA区域的吸引力将标记的首选位点从与核小体耗尽区（NDR）毗邻的核小体转移到NDR本身。值得注意的是，在暂停的RNA聚合酶II（RNAPII）的上游，几乎所有转录偶联的可及位点都对应于ATAC-seq位点，反之亦然。由于紧密对应的之间所产生的“CUTAC”（Ç leavage û的nDer Ť argeted甲ccessible Ç hromatin）映射和DNA酶I和ATAC- SEQ染色质可访问映射，我们的结论是，染色质访问性是由RNAPII转录起始驱动（参见Henikoff等人。，2020） ，支持以前的建议，活性的启动子和增强子由相同的调节特征架构（安德森等人，2015;阿诺德等人，2019） 。在我们的最初的CUTAC研究中，我们所描述的三种不同的修改CUT＆标签直接用于访问站点映射协议：tagmentation中的MgCl 2与一个300mM的NaCl和PA-Tn5转（或商业PAG-Tn5转的20倍稀释液与两个A蛋白和蛋白G IgG特异性），在低盐标记之前去除过量的pAG-Tn5以及在300 mM洗涤步骤后进行低盐标记。我们采用了洗后标记，其步骤与原始CUT＆Tag-direct协议（Kaya-Okur等，2020）中的步骤相同，仅更改了标记缓冲液的成分。如在此报道，在此CUTAC协议RNAPII导致精确染色质可接近性起始形式的应用映射与异常高的信号-噪声。通过拴系到转录机制本身而获得的改进进一步支持了染色质在增强子和启动子处的可及性的转录偶联基础。从先前冷冻的天然或轻度交联的细胞核到纯化的可测序的文库，CUT＆Tag和CUTAC可以在一天内同时进行，所有步骤均在单个PCR管中进行。我们提供了一个简化的协议，其中从核到纯化的可测序文库的所有步骤均在家用台式机上使用多余的设备和无毒试剂进行（图1）。我们的CUTAC结果使用了最大RNAPII亚基（RNAPIIS5P）的重复七聚体C末端结构域的丝氨酸5磷酸化起始形式的抗体，与最佳ATAC-seq数据相比具有优势，同时提供了起始的全基因组图谱形式的RNAPII。该协议的简单性和经济性使它同样适合于实验室，家庭，或教室环境。","journal":"BIO-PROTOCOL","year":2021,"id":169352,"datarank":0.0,"base_score":0.0,"endowment":0.0,"self_citation_contribution":0.0,"citation_network_contribution":0.0,"self_endowment_contribution":0.0,"citer_contribution":0.0,"corpus_percentile":null,"corpus_rank":null,"citation_count":29,"citer_count":0,"citers_with_citation_signal":0,"citers_with_endowment":0,"datacite_reuse_total":0,"is_dataset":false,"is_dataset_confidence":0.9566,"is_data_producer":false,"deposit_databanks":null,"is_oa":true,"file_count":0,"downloads":0,"has_version_chain":false,"published_date":"2021-01-01","fair_score":null,"fair_percentile":null,"algorithm_id":"datarank_citation_only_1hop_v6","ranking_scope":"data_only","authors":[{"id":256946,"name":"Jorja G. 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