{"doi":"10.21769/bioprotoc.3785","title":"Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Meiotic Divisions in Caenorhabditis elegans Males","abstract":"Live-imaging of meiotic cell division has been performed in extracted spermatocytes of a number of species using phase-contrast microscopy. For the nematode Caenorhabditis elegans, removal of spermatocytes from gonads has damaging effects, as most of the extracted spermatocytes show a high variability in the timing of meiotic divisions or simply arrest during the experiment. Therefore, we developed a live-cell imaging approach for in situ filming of spermatocyte meiosis in whole immobilized C. elegans males, thus allowing an observation of male germ cells within an unperturbed environment. For this, we make use of strains with fluorescently labeled chromosomes and centrosomes. Here we describe how to immobilize male worms for live-imaging. Further, we describe the workflow for the acquisition and processing of data to obtain quantitative information about the dynamics of chromosome segregation in spermatocyte meiosis I and II. In addition, our newly developed approach allows us to re-orient filmed spindles in silico, regardless of the initial 3D orientation in the worm, and analyze spindle dynamics in living worms in a statistically robust manner. Our live-imaging approach is also applicable to C. elegans hermaphrodites and should be expandable to other fluorescently labelled nematodes or other fully transparent small model organisms., [摘要] 用相差显微镜对一些物种的精母细胞进行了减数分裂的实时成像。对于秀丽隐杆线虫来说，去除生殖腺中的精母细胞具有破坏性作用，因为大多数精母细胞在减数分裂的时间上表现出高度的变异性，或者只是在实验中停止。因此，我们开发了一种活体细胞成像方法，用于原位拍摄固定化线虫雄性精母细胞减数分裂过程，从而可以在不受干扰的环境中观察雄性生殖细胞。为此，我们利用带有荧光标记染色体和中心体的菌株。在这里我们描述如何固定男性蠕虫进行实时成像。此外，我们描述了获取和处理数据的工作流程，以获得有关精母细胞减数分裂I和II中染色体分离动态的定量信息。此外，我们最新开发的方法允许我们在电子显微镜中重新定位胶片上的主轴，而不管蜗杆的初始3D方位如何，并以统计稳健的方式分析活蠕虫的纺锤动力学。我们的实时成像方法也适用于秀丽隐杆线虫雌雄同体，并且可以扩展到其他荧光标记的线虫或其他完全透明的小型模型生物。 [背景] 过去，对雄性减数分裂的研究是在分离和染色的标本上进行的，以显示减数分裂纺锤体的图像，但使用固定标本有明显的局限性（Boring，1909；Boveri，1909；Goldstein，1977）。应用实时成像技术分析了一些物种的精母细胞减数分裂的动态，包括蝗虫（Nicklas和Staehly，1967；Nicklas和Koch，1969；Ault，1986）、鹤-蝇肾瘤-缝合器（Janicke and LaFountain，1982；LaFountain等人，2002和2012；Forer等人，2018）、扁虫Mesostoma ehrenbergii（Fegaras和Forer，2018年）、果蝇果蝇（Bonaccorsi和Gatti，2017年）和蜘蛛（Golding和Paliulis，2011年；Feelt等人，2017年）。用相差显微镜和偏振光显微镜观察提取的昆虫精母细胞，并使用微操作器和激光显微手术在纺锤体或单染色体上进行了非常优雅的实验（King和Nicklas，2000；Nicklas等人，2001；Forer等人，2013；Sheykhani等人，2017）。一般来说，这种方法的一个局限性是必须从性腺中取出细胞，并且必须为每个实验制定详细的方案，使用特定的生物体来解释培养基的生理要求（即pH、渗透压和温度）。在线虫秀丽隐杆线虫中，精母细胞减数分裂的显微研究以前是通过用抗体标记分离的和固定的性腺来实现的（Howe等人，2001；Shakes等人，2009；Peters等人，2010；Schvarzstein等人，2013）。这种方法虽然对分析雄性减数分裂纺锤体的分子组成非常有效，但不能用来研究纺锤体的动力学。另外，男性性腺可以被解剖，提取的生殖细胞可以用Normarski光学系统拍摄下来。应用这种方法（图1A-1D），可以拍摄细胞分裂，但没有合适的荧光标记，减数分裂纺锤体的组成部分（如染色体和纺锤体极）不可能可靠地检测到（Shakes等人，2009；Gleason等人，2012；Vielle等人，2016；Hu等人，2019）。此外，由于细胞在减数分裂完成前会有规律地停滞，所以成像时间仅限于几分钟。在我们手中，大约90%的精母细胞在减数分裂结束之前由于未知原因而停滞。我们开发了一种实时成像方法，使我们能够研究活体固定男性的三维纺锤体动力学（图1E-1G）。利用这种新开发的方法，现在可以在90分钟内实现多个主轴的平行成像，而不会对主轴动力学产生任何破坏性影响（Fang Yen等人，2009年；Kim等人，2013年）。另一种方法是使用乙烯基记录作为模具创建的图案琼脂糖垫（Rivera Gomez和Schvarzstein，2018）。然而，这种方法依赖于使用麻醉剂来完全固定蠕虫进行成像。在这里，我们打算避免使用麻醉剂固定动物，从而排除药物对细胞分裂动力学的任何可能的副作用。这种方法必须解决的一个技术问题是在成像过程中荧光标记的漂白，即必须在记录开始后约1.5小时制备新样品。然而，单梭形细胞分裂的数量足以确定动物精母细胞的分裂特征。挑战在于计算出主轴随时间的变化特性。由于三维实时成像主轴在成像平面上没有完全对齐，而是在三维中随机定向，在每个帧中主轴角度不同。我们解决了这个问题，通过计算旋转每个轴在三维有一个标准的方向数据分析，然后计算每个荧光通道的Kymograph。通过对Kymograph的分析，我们可以高精度地确定染色体和纺锤体极随时间的动态变化。此外，此工作流程可用于图像分割的有丝分裂生殖细胞在远端的男性和两性生殖腺，这也是一种很难在原位成像的细胞类型。我们所建立的线虫雄性细胞分裂图像采集和数据处理流程，也可以应用于本种雌雄同体胚胎分裂的成像，也可以应用于其他带有荧光标记染色体和中心体的小型模型生物。 图1。线虫雄性生殖细胞的影像学研究。 A、 野生型（Bristol N2）男性初级精母细胞的DIC成像。细胞处于前中期，染色体在细胞中心可见。黑色箭头表示中心体的大致位置，白色箭头表示染色体。B、 中期的细胞。晚期的分化细胞。完成第一次减数分裂的细胞。漂白校正后固定化雄性（菌株TMR17）的（A-D）2µm.E.荧光图像比例尺。此图像是21个z切片的投影，在开始数据采集后一分钟内拍摄。染色体呈纺锤体状，染色质为红色。插图（红色框）显示中期I轴。F、 图像采集开始后27分钟，24个z切片的投影。在这个视野中，性腺的不同区域被显示出来。这些区域包括减数分裂前期，减数分裂Ⅰ和Ⅱ的各种减数分裂，以及成熟精子。插图（红色框）显示后期I纺锤体。G、 21个z切片的投影，开始图像采集后61分钟。插图（红色框）显示中期II中的两个主轴，比例尺为（E-G），5µm。","journal":"BIO-PROTOCOL","year":2020,"id":109794,"datarank":0.0,"base_score":0.0,"endowment":0.0,"self_citation_contribution":0.0,"citation_network_contribution":0.0,"self_endowment_contribution":0.0,"citer_contribution":0.0,"corpus_percentile":null,"corpus_rank":null,"citation_count":8,"citer_count":0,"citers_with_citation_signal":0,"citers_with_endowment":0,"datacite_reuse_total":0,"is_dataset":false,"is_dataset_confidence":0.9271,"is_data_producer":false,"deposit_databanks":null,"is_oa":true,"file_count":0,"downloads":0,"has_version_chain":false,"published_date":"2020-01-01","fair_score":null,"fair_percentile":null,"algorithm_id":"datarank_citation_only_1hop_v6","ranking_scope":"data_only","authors":[{"id":524479,"name":"Falko Löffler","orcid":null,"position":1,"is_corresponding":false},{"id":524480,"name":"Christian Götze","orcid":null,"position":2,"is_corresponding":false},{"id":302009,"name":"Thomas Müller‐Reichert","orcid":"0000-0003-0203-1436","position":3,"is_corresponding":false},{"id":459731,"name":"Gunar Fabig","orcid":"0000-0003-3017-0978","position":0,"is_corresponding":true}],"reference_count":32,"raw_metadata":null,"created_at":"2026-07-18T23:12:54.309019Z","pmid":"33659440","pmcid":null,"fwci":null,"citation_percentile":null,"influential_citations":0,"oa_status":null,"license":null,"views":0,"total_file_size_bytes":0,"version_count":0,"fair_f":null,"fair_a":null,"fair_i":null,"fair_r":null,"fair_zscore":null,"fair_rationale":null,"fair_model":null,"fair_agent_version":null,"fair_fulltext_source":null,"fair_has_llm":null,"fair_computed_at":null,"clinical_trials":[],"software_tools":[],"db_accessions":[],"linked_datasets":[],"topics":[]}