{"doi":"10.21769/bioprotoc.3756","title":"A Workflow for Ultra-rapid Analysis of Histone Post-translational Modifications with Direct-injection Mass Spectrometry","abstract":"Chromatin modifications, like histone post translational modifications (PTMs), are critical for tuning gene expression and many other aspects of cell phenotype. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) has become the most suitable method to analyze histones and histone PTMs in a large-scale manner. Selected histone PTMs have known functions, and their aberrant regulation is linked to a wide variety of diseases, including cancer. However, histone analysis is scarcely used in diagnostics, partially due to the limited throughput and not ideal reproducibility of LC-MS based analysis. We describe a workflow that allows for high-throughput sample preparation is less than a day using 96-well plates. Following preparation, samples are sprayed into MS without LC, using an automated direct injection (DI-MS) method. Each analysis provides accurate quantification for 29 peptide sequences with 45 PTMs (methylations, acetylations and phosphorylations) for a total of 151 histone marks plus 16 unmodified histone peptides for relative quantification of histone variants. This workflow allows for < 1 min MS runs and higher reproducibility and robustness due to the absence of carryover or LC-based batch effects. Finally, we describe an engineered peptide sequence used to accurately monitor the efficiency of sample preparation, which can be detected during the DI-MS run., [抽象]像组蛋白翻译后修饰（PTM）一样，染色质修饰对于调节基因表达和细胞表型的许多其他方面至关重要。液相色谱-质谱联用（LC-MS）已成为最适合大规模分析组蛋白和组蛋白PTM的方法。选定的组蛋白PTM具有已知功能，其异常调节与包括癌症在内的多种疾病有关。但是，组蛋白分析很少用于诊断中，部分是由于通量有限且基于LC-MS的分析的重现性不理想。我们描述了一种使用96孔板进行少于一天的高通量样品制备的工作流程。制备后，使用自动直接进样（DI-MS）方法将样品喷雾到无LC的MS中。每次分析都可以通过45个PTM（甲基化，乙酰化和磷酸化（共151个组蛋白标记）和16个未修饰的组蛋白肽进行组蛋白变体的相对定量。由于没有残留或基于LC的批处理效应，该工作流程允许MS运行少于1分钟，并具有更高的重现性和耐用性。最后，我们描述了一种工程化的肽序列，用于精确监控样品制备的效率，可以在DI-MS运行期间检测到该效率。[背景] 组蛋白是具有球形头部和N末端尾巴的碱性蛋白质，富含精氨酸和赖氨酸残基。一对典型的组蛋白H2A，H2B，H3和H4（称为核心组蛋白）形成一个八聚体，其周围147 bp的DNA缠绕形成核小体。这些核心组蛋白的尾巴被共价翻译后修饰（PTM）广泛修饰，包括甲基化，磷酸化和包括乙酰基，糖衍生物在内的酰基，以及数百个其他基团，主要位于赖氨酸残基上（图1）（Zhao和Garcia， 2015）。这些组蛋白PTM通过改变DNA-组蛋白界面的电荷并充当与染色质相关的蛋白质的停靠位点来调节染色质的紧缩。图1. DI-MS工作流程的优点。复用从提取到衍生/消化以样品制备desating 以高通量方式进行。样品制备仍需要至少一天才能使组蛋白准备好进行分析。但是，该工作流程允许在单个批次中复用潜在的数千个样品，然后可以每分钟一个的速率对其进行分析。实际上，当同时处理四个96孔板时，可以在正常的一周（5天的工作时间）中分析大约344个样品。该能力比任何现有的分析组蛋白修饰的诊断工具都要高。每个样品可在一周内获得来自45个基因组的29种肽的220种相对定量数据，这些肽属于16种组蛋白类型（正典和变异），在全部45个基因座中带有单个或多个PTM，例如甲基化，乙酰化和磷酸化。 每个真核细胞均具有紧密调节的染色质状态，无论是多能的还是分化的，健康的或患病的。主动转录的染色质结构域通常称为常染色质，而沉默的隔离染色质结构域定义为异染色质。虽然乙酰化通常分配给可及的染色质，但异染色质与更精确的组蛋白标记相关。例如，赖氨酸9在组蛋白H3（H3K9me）上的甲基化是异染色质蛋白1（HP1）的靶标，并且众所周知的是产生组成性沉默的染色质结构域（Nakayama 等，2001）。其他赖氨酸甲基化还具有其他生物学作用。H3K27三甲基化是另一种异色标记，而H3K4，H3K36或H3K79的甲基化与活性染色质相关（Maison和Almouzni，2004； Peterson和Laniel，2004； Bannister 等，2005）。我们越来越认识到，不同修饰之间的串扰是染色质功能的额外调节水平（Kouzarides，2007）。在这种情况下，差异量化（例如，H3K9me3与H3K9me3K14ac在染色质上的相对丰度）的能力允许定义组蛋白PTM 的共存频率。 由于以下原因，传统的基于抗体的方法在组蛋白PTM分析中非常受限制：（i ）只有很少的抗体能够识别多个PTM。（ii）用这种方法只能研究已知的修改；（iii）研究组合密码所必需的基于抗体的技术很少能大规模采用；（iv）抗体对组蛋白PTM的特异性，即使是商业性的，有时也不足够。Egelhofer 及其同事报告说：“超过25％的商业抗体未通过点印迹或蛋白质印迹进行特异性测试；在特异性抗体中，有超过20％在染色质免疫沉淀实验中失败” （Egelhofer 等，2011 ）。质谱（MS）当前是研究新型和/或组合PTM的最合适的分析工具，尤其是由于其高灵敏度，高质量准确度以及进行大规模分析的可能性。 用于组蛋白分析的最广泛采用的蛋白质组学工作流程是所谓的“自下而上”方法，其中将组蛋白消化为4-20个氨基酸长的肽。我们和其他人已经优化了一种协议，该协议允许使用胰蛋白酶作为消化酶（在K / R后裂解），尽管组蛋白上的精氨酸（R）和赖氨酸（K）残基的频率很高，即占所有残基的30％氨基酸。然后，通过丙酰化（Sidoli 等，2015）或重标记的乙酰化（Bonaldi 等，2004）衍生化未修饰的单甲基化赖氨酸残基，以防止胰蛋白酶切割赖氨酸。在液相色谱与质谱联用（LC-MS）的同时，这会产生适当大小的肽，以实现最佳离子化效果。然而，使用液相色谱存在一些固有的问题，例如柱条件产生的批量效应，较长的梯度在线分离肽，从而限制了样品通量和不同肽的不可预测的电离效率。尽管在不同时间（甚至由同一个人）执行样品制备而产生的一些批处理效应和质谱仪的校准状态仍然持续存在，但使用此方法，HPLC有助于MS辅助PTM分析的巨大差异已大大降低了。 DI-MS（Sidoli 等人，2015 ）。良好实验室规范SUC ，包括编制和分析有关研究在高通量的方式将所有红眼样品H ê一批影响。我们还建议确保样品相对不含可电离的污染物，因为这些“背景”干扰会导致质谱分析中样品特异性信号的抑制。样品清除非常重要，因为注入污染物会减少S透镜在射频引导下的离子传输，从而导致数据采集质量差和仪器维护成本昂贵。总而言之，DI-MS可以直接在具有处理LC-MS仪器技术专长的质谱实验室或核心设施中实施。 如本协议所述，一旦建立了高通量定量组蛋白PTM分析，研究人员将有极大的机会在自己的实验室中检查生物学过程和疾病的缺失表观遗传方面。此外，每周可生成300多个样本的大约200条信息，使其特别适合发现疾病的表观遗传生物标记。 尽管DI-MS可以针对包括代谢物（Kirwan 等，2014 ）和核酸（Quinn 等，2013 ）的任何分析物进行优化，但由于我们熟悉PTM分析，因此我们利用了高通量的注入流程与之相关的优势和挑战，以及对基础科学和疾病表型的重要性。组蛋白的某些特性使其可以在质谱仪中进行干净的提取，理想的蛋白水解和独立于数据的采集（DIA）。与DNA（染色质）相关","journal":"BIO-PROTOCOL","year":2020,"id":100201,"datarank":0.0,"base_score":0.0,"endowment":0.0,"self_citation_contribution":0.0,"citation_network_contribution":0.0,"self_endowment_contribution":0.0,"citer_contribution":0.0,"corpus_percentile":null,"corpus_rank":null,"citation_count":29,"citer_count":0,"citers_with_citation_signal":0,"citers_with_endowment":0,"datacite_reuse_total":0,"is_dataset":false,"is_dataset_confidence":0.9502,"is_data_producer":false,"deposit_databanks":null,"is_oa":true,"file_count":0,"downloads":0,"has_version_chain":false,"published_date":"2020-01-01","fair_score":null,"fair_percentile":null,"algorithm_id":"datarank_citation_only_1hop_v6","ranking_scope":"data_only","authors":[{"id":247704,"name":"Simone Sidoli","orcid":"0000-0001-9073-6641","position":1,"is_corresponding":false},{"id":227837,"name":"Benjamin A. García","orcid":"0000-0002-2306-1207","position":2,"is_corresponding":false},{"id":242919,"name":"Natarajan V. Bhanu","orcid":"0000-0002-1294-0062","position":0,"is_corresponding":true}],"reference_count":19,"raw_metadata":null,"created_at":"2026-07-18T22:38:35.493878Z","pmid":"33659415","pmcid":null,"fwci":null,"citation_percentile":null,"influential_citations":0,"oa_status":null,"license":null,"views":0,"total_file_size_bytes":0,"version_count":0,"fair_f":null,"fair_a":null,"fair_i":null,"fair_r":null,"fair_zscore":null,"fair_rationale":null,"fair_model":null,"fair_agent_version":null,"fair_fulltext_source":null,"fair_has_llm":null,"fair_computed_at":null,"clinical_trials":[],"software_tools":[],"db_accessions":[],"linked_datasets":[],"topics":[]}